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原位雜交
本詞條是多義詞，共3個(gè)義項
用于基因定位的技術(shù)
原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進(jìn)行。有熒光原位雜交。
基本信息
| 中文名 | 原位雜交 |
| 外文名 | in situ hybridization |
| 運用領(lǐng)域 | 生物學(xué) |
| 影響 | |
| 應用 | 基因定位、病毒檢測等 |
概述
將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱(chēng)為原位雜交！使用DNA或者RNA探針來(lái)檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。
RNA原位核酸雜交又稱(chēng)RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀(guān)察其細胞內相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術(shù)經(jīng)不斷改進(jìn)，其應用的領(lǐng)域已遠超出DNA原位雜交技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時(shí)在分析低豐度和罕見(jiàn)的mRNA表達方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。
原位雜交
原理
原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專(zhuān)一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物(曾呈奎等2000)。
組織診斷在許多生命中扮演著(zhù)至關(guān)重要的作用，專(zhuān)注于質(zhì)量、速度和效率將會(huì )產(chǎn)生很大的變化。原位雜交離不開(kāi)染色，高級染色的各個(gè)方面，以及量身定制解決方案所需的選件，都整合到IHC和ISH染色之中。
實(shí)驗步驟
質(zhì)粒制備
1質(zhì)粒的轉化和擴增
1．取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mlLB培養基的錐形瓶中，37℃、100rpm培養4h，離心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重懸細菌，冰浴30min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細菌，分裝(200μ／tube)，-80℃保存。
2．轉化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質(zhì)粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。
3．輕輕搖勻，冰浴30min。
4．42℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5．加入LB培養液(無(wú)氨芐青霉素)0.8ml，在37℃，100轉／min水浴孵育60min。
6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的LB-氨芐青霉素50mg／ml,1μl／ml培養基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培養12-16h。
1．用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養液的離心管中，于37℃，200轉／分培養2h，取1ml之一EPPENDORF離心管，加50μl10mmol／LEDTA(pH8.0)。
3．在70℃溫育5min，然后冷卻到室溫。
4．加1.5μ14mol／LKCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。
5．12000g，4℃離以3min，以除去細菌碎片。
1.3質(zhì)粒的擴增和純化
1．用無(wú)菌牙簽分別挑取單個(gè)白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素(50μg／ml)培養液的聚丙烯管中，于37℃，200轉／分培養3h。
2．將菌液轉入含70mlLB-氨芐青霉素培養液的250ml錐形瓶中，37℃，200轉／分培養過(guò)夜(12-16h)，細菌渾濁。
4.將培養的細菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4℃離,th,15min，沉淀細菌。
5.棄凈上清夜，用2ml預冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5min
6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃動(dòng)10秒，顛倒數次后，于室溫靜置10min。
7.加入預冷的溶液III3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10min，出現白色絮狀沉淀。
8．6000rpm，4℃離心15min，保留上清。
10.12000rpm，4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
12．用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉移至1.5mlEppendorf管中。
13．加入用冰預冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000rpm，4℃離心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。
15.12000rpm,4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。
16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
17.400μl含無(wú)DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉移到另－1.5mlEppendorf管中，室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。
21．于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開(kāi)管口，置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
22．加入400μl處于4℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4℃12000rpm離心2min。
23．吸去上清，室溫敞開(kāi)管口，直到乙醇完全揮發(fā)。
24．用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260／OD280>1.8。OD260／OD280對DNA而言其值大約為
26．質(zhì)粒DNA溶液于-20℃保存待用。
探針標記
3．進(jìn)行體外轉錄，步驟如下：
質(zhì)粒DNA模板0.05μg／μl1μl
10xNTP地高辛標記混合物1x2μl
0.1MDTT溶液10mM2μl
RNAse抑制劑2U／μl1μl
RNA聚合酶2U/μl2μl
反應體系總體積20μl
5．加入上述各試劑后，混勻，簡(jiǎn)短離心后在37℃孵育2h。
6．加入2μl無(wú)RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37℃孵育15min降解模板DNA。
8．加入2.5μl的4MLicl和7.5μl冷的無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置2h。
9．12000g下離以15min，棄上清，小心地用50μl冷的70％乙醇洗滌沉淀。
10．室溫下稍干燥，溶于100μ1DEPC處理過(guò)的三蒸水中，混勻分裝，-20℃下保持備用。
步驟
3.1冰凍切片與雜交前預處理
1．將子宮樣品從-80℃取出，用OCT包埋，在-23℃(切片機腔體溫度)平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續組織切片，平鋪于涂有多聚賴(lài)氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片預先經(jīng)180℃干烤6小時(shí))，保存于-70℃冰柜備用。
2．冰凍切片經(jīng)室溫干燥10min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH7.4)固定l0min。
5．在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37℃孵育15min，重復步驟4)。
6．經(jīng)0.1MTEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1MTEA(乙酸酐／三乙醇胺，pH8.0)中乙酰化10min。(在大多數實(shí)驗中，步驟4，5，6省略)
7．5xSSC中平衡15min。
3.2雜交
8．在脫水后的玻片上滴加預雜交液(約100μl／玻片)，置于放有濕盒液(50％甲酰胺v／v；0.3MNaCl；1MmEDTA；10mMTris-Cl，pH8.O)的濕盒中，55～58℃下的烘箱中預雜交2h。
9．甩掉預雜交液，地高辛標記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng／μl)經(jīng)70℃變性1O分鐘，置冰上1min，玻片上滴加預雜交液(約60μl／玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48～58℃下雜交18-30h。
3.3雜交后處理
10．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52℃預熱的5×SSC洗30min。
11．在無(wú)DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37℃下孵育30min。
12．分別依次用52℃預熱的2XSSC，1XSSC和O.1XSSC洗2次，每次30min。
3.4雜交信號檢測
13．在緩沖液A(0.1MTris-HC1pH7.5，0.15MNaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1：500～1:2000稀釋于含0.5％阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應2h。
15．用緩沖液A洗2次，每次15min。
18．充分顯色后，用EDTA(1mMEDTA，pH8.0)洗15min終止反應。
19．在95％乙醇中洗lh以除去非特異的背景。
20．用蒸餾水洗15min除去可能存在的結晶體。
22．充分干燥后在顯微鏡下觀(guān)察、照相。
前固定
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（InSituHybridizationHistochemistry,ISHH）在固定劑的應用和選擇上應兼顧到三個(gè)方面：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細胞或組織。DNA是比較穩定的，mRNA是相對穩定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來(lái)說(shuō)，固定劑的種類(lèi)和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類(lèi)濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結果時(shí)應考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時(shí)間對RNA保存所帶來(lái)的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會(huì )與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì )影響探針穿透入細胞或組織。
其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿(mǎn)意的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過(guò)夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數月之久不會(huì )影響雜交結果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時(shí)，在包埋的過(guò)程中可減低mRNA的含量。
其它固定劑如應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿(mǎn)意效果。各種固定劑均有各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結構有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結構，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認為ISHH較為理想的固定劑。
處理
1．玻片的處理。玻片包括蓋片和載片應用熱肥皂刷洗，自來(lái)水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過(guò)夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無(wú)塵存放。由于ISHH的實(shí)驗周期長(cháng)，實(shí)驗程序繁雜，因此，要應用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應用，以保證在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得，但在長(cháng)周期實(shí)驗過(guò)程中，粘附效果不夠理想。多聚賴(lài)氨酸液具有較好的粘附效果，但價(jià)格昂貴，需進(jìn)口。
2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性。此步驟根據應用固定劑的種類(lèi)、組織的種類(lèi)、切片的厚度和核酸探針的長(cháng)度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應用較強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱(chēng)清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無(wú)疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時(shí)也會(huì )減低RNA的保存最和影響組織結構的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應慎為掌握。
蛋白酶K（ProteinaseK）的消化作用在ISHH中是應用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時(shí)間視組織種類(lèi)、應用固定劑種類(lèi)、切片的厚薄而定。一般應用酶K1μg/ml(于0.1mol/LTris/50mmol/LEDTA,pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著(zhù)靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K消化后，應用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結構，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報告應用胃蛋白酶（pepsin）20～100μg/ml（用0.1NHCl配）37℃、30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗結果優(yōu)于蛋白酶K。
不少實(shí)驗工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（aceticanhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/LNaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著(zhù)名學(xué)者卻對此持有異議，根據他們的實(shí)驗和經(jīng)驗證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。
3．減低背景染色。和免疫細胞化學(xué)染色一樣ISHH實(shí)驗程序中，如何減低背景染色是一個(gè)重要的問(wèn)題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。預雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。有的實(shí)驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內源性的RNA酶，減低背景染色。
4．防止RNA酶的污染。由于在手指皮膚及實(shí)驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗結果，在整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗用玻璃器皿及鑷子都應于實(shí)驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國外實(shí)驗室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出時(shí)空氣污染。在無(wú)高溫消毒的烤箱時(shí)，亦可用國內出產(chǎn)的衛生蒸汽消毒鍋（山東新華醫療器材廠(chǎng)生產(chǎn)）。雜交前及雜交時(shí)所應用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
過(guò)程
雜交（Hybridisation），在ISHH，整個(gè)實(shí)驗周期是比較長(cháng)的，實(shí)驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個(gè)實(shí)驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個(gè)環(huán)節。
雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內向正華等采用無(wú)菌的蠟膜代替硅化的蓋玻片也可獲得滿(mǎn)意的實(shí)驗結果。加蓋片的目的是防止孵育過(guò)程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發(fā)。因此，也有為穩妥起見(jiàn)，在蓋玻片周?chē)右后w石蠟封固的，但作者認為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導致雜交液的污染，必要時(shí)可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無(wú)雜質(zhì)，光滑不會(huì )產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育時(shí)間較長(cháng)時(shí)，為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，可將復有硅化蓋玻片進(jìn)行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standardsalinecitrate,SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進(jìn)行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。
如前所述，雜交前的準備只是為雜交的成功奠定基礎，要獲得滿(mǎn)意的實(shí)驗結果，在雜交這一實(shí)驗過(guò)程中還須注意以下的環(huán)節。
①探針的濃度。很難事先確定每一種實(shí)驗探針的濃度，但要掌握一個(gè)原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關(guān)。根據國內外實(shí)驗工作者的經(jīng)驗，認為最佳原則應是應用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結合度為目的。這和我們在免疫細胞化學(xué)試驗中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。探針濃度依其種類(lèi)和實(shí)驗需要略有不同，根據筆者的經(jīng)驗及所查閱文獻，在原位雜交細胞化學(xué)中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。
根據Heinz、Hofelt實(shí)驗室經(jīng)驗，對放射性標記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認為生物素標記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授實(shí)驗室應用于放射性標記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標記（生物素或地高辛）cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應用地高辛標記生長(cháng)抑素cRNA探針獲得滿(mǎn)意結果，其探針濃度為0.5ng/μl。必須強調的是，國內外實(shí)驗室都證明加雜交液的量要適當，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過(guò)多不僅造成浪費，而且液量過(guò)多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過(guò)量的雜交液含核酸探針濃度過(guò)高，反易導致高背景染色等不良后果。
②探針的長(cháng)度。一般應用于ISHH探針的最佳長(cháng)度應在50～100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。據報告，長(cháng)500個(gè)堿基的探針，其雜交時(shí)間約需20h左右。200～500個(gè)堿基的探針仍可應用，如超過(guò)500個(gè)堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn)行水解，使其變成短的片段，達到實(shí)驗所需求的堿基數。
③雜交的溫度和時(shí)間。雜交的溫度也是雜交成功與否的一個(gè)重要環(huán)節。在第十八章概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（meltingtemperature,簡(jiǎn)稱(chēng)Tm）。原位雜交中，多數DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。McConaughy報告，反應液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調節鹽濃度的辦法來(lái)調節Tm。Tm的計算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長(cháng)度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。
由于鹽和甲酰胺濃度的調節等因素，實(shí)際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據探針的種類(lèi)不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細胞內靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時(shí)間5～15min，（有作用報告在105℃微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復性，再置入盛有2×SSC的溫盒內，在37～42℃孵育雜交過(guò)夜。雜交的時(shí)間如過(guò)短會(huì )造成雜交不完全，而過(guò)長(cháng)則會(huì )增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應時(shí)間在3h左右。Barns等（1987）報告用DNA探針雜交，其反應完成時(shí)間為2～4h。但為穩妥起見(jiàn)，一般將雜交反應時(shí)間定為16～20h，或為簡(jiǎn)便起見(jiàn)雜交孵育過(guò)夜，從現有文獻報告看無(wú)不良結果。當然，雜交反應的時(shí)間與核酸探針長(cháng)度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應時(shí)間應予考慮，并經(jīng)反復實(shí)驗確定。有作者主張雜交反應的孵育應在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，因為光線(xiàn)會(huì )促進(jìn)甲酰胺的電離作用。
④雜交嚴格度（Hybridizationstringency）。雜交條件的嚴格度（stringency）表示通過(guò)雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對(mismatch)雜交的穩定性較完全配對雜交體差，因此，通過(guò)控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應亦然。一般來(lái)說(shuō)，低嚴格度（lowstringency）雜交及沖洗條件在Tm-35℃至Tm–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結合，其結果是導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴格度，Tm-20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴格度（highstringency）為T(mén)m-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。
在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩定的結合。麥躍行裝用地高辛標記原位雜交技術(shù)檢測尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結果發(fā)現在嚴格條件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的檢出率和陽(yáng)性率明顯低于非嚴格條件下（Tm-35℃），其相差非常明顯（P<0.001）。因為，在嚴格條件下只有同源性很強的DNA才被檢出，而在非嚴格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對病毒DNA分型需在高嚴格條件下進(jìn)行，而低嚴格條件則可用于對病毒感染進(jìn)行篩選。由于原位雜交技術(shù)多數是在Tm-25℃進(jìn)行的，不屬于高嚴格范圍，無(wú)疑會(huì )產(chǎn)生非特異性結合導致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后處理洗滌的嚴格度使非特異性的雜交體減少。
由于RNA雜交的穩定性，應用cRNA探針進(jìn)行細胞或組織的原位雜交時(shí)的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實(shí)驗證明，cRNA產(chǎn)生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。
⑤硫酸葡聚糖（Dextransulphate）和甲酰胺（formamide）。硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。甲酰胺的主要作用在上節已提及，在調節雜交反應溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結構。甲酰胺還可防止在低溫時(shí)非同源性片段的結合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩定的作用。
后處理
雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學(xué)的實(shí)驗程序中，這也是一個(gè)重要的環(huán)節。特別因為大多數的原位雜交實(shí)驗是在低嚴格度條件下進(jìn)行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。RNA探針雜交時(shí)產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過(guò)雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數和時(shí)間因核酸探針的類(lèi)型和標記的種類(lèi)不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過(guò)程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結合，從而增強了背景染色。放射性標記探針雜交后漂洗過(guò)程中可用底片曝光的方法檢測背景染色（非特異性標記的多少）作為改善漂洗程序的指針。在35S標記的核酸探針在漂洗液中須加入14mmol/L的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸鹽（thiosulphate），以防止35S標記的核酸探針被氧化?？傊?，如何控制漂洗的嚴格度從而達到理想的信/噪比無(wú)既定方案可循，必須從反復的實(shí)踐中取得經(jīng)驗。
顯示
顯示又可稱(chēng)為檢測系統（Detectionsystem）。根據核酸探針標記物的種類(lèi)分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測系統進(jìn)行不同顯色處理。細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer–assistedimageanalysis）檢測銀粒的數量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類(lèi)型和數量的核酸的顯色強度進(jìn)行檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴格控制實(shí)驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時(shí)間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。
例子
對分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時(shí)，可采用該方法。將這些菌落歸并到一個(gè)瓊脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養一段時(shí)間后，對菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。
1.將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上
(2)用無(wú)菌牙簽將各個(gè)菌落先轉移至濾膜上，再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進(jìn)行劃線(xiàn)接種（或打點(diǎn)）。每菌落應分別劃線(xiàn)于兩個(gè)平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒（如pBR322）的菌落。
(5)用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放于4℃，直至獲得雜交反應的結果。
(6)裂解細菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結合于硝酸纖維素濾膜。
2.菌落的裂解及DNA結合于硝酸纖維素濾膜
（1)在一張保鮮膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/LNaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到小洼上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于原處2-3分鐘?！ ?2)用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/LNaOH重復步驟（1）。
(3)吸干濾膜，將濾膜轉移到新的帶有1mol/LTris·Cl(pH7.4）的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜，再重復一次該步驟。
(4)吸干濾膜，把它轉移到有1.5mol/LNaCl、0.5mol/LTris·Cl(pH7.4）的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜，轉移到一張干的濾紙上，置于室溫20-30分鐘，使濾膜干燥?！ ?5)將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80℃干烤2小時(shí)，固定DNA。
(6)將固定在膜上的DNA與32P標記的RNA進(jìn)行雜交。
3.雜交
(2)將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起，放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿，放到位于培養箱內的旋轉平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中，應緩緩搖動(dòng)濾膜，防止它們粘在一起。
(3)用泡過(guò)預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片，以降低雜交背景而不影響陽(yáng)性雜交信號的強度和清晰度。
(4)將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中，在適宜溫度（即在水溶液中雜交時(shí)用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時(shí)用42℃）下，預雜交1-2小時(shí)。
(7)68℃用300-500ml1×SSC和0.1%SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時(shí)。此時(shí)已可進(jìn)行放射自顯影。如背景很高或實(shí)驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml0.2×SSC和0.1%SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8)把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后，把濾膜（編號面朝上）放在一張保鮮膜上，并在保鮮膜上作幾個(gè)不對稱(chēng)的標記，以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。
(9)用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X(jué)光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時(shí)。
(10)底片顯影后，在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽(yáng)性雜交信號的位置，同時(shí)在不對稱(chēng)分布點(diǎn)的位置上作出標記?？蓮牡灼先∠?/span>透明紙，通過(guò)對比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來(lái)鑒定陽(yáng)性菌落。
試驗
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素?；蛘呤褂帽?/span>锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成)
一.原位雜交第一天
1.重新水化和固定
1）吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。
2）置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3）置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次
4）置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5）用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實(shí)驗不做此步）
1）用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(cháng)。發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(cháng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。
2）用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4）用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2.預雜交
1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）60℃水浴，預雜交4小時(shí)以上。
3.雜交
1）吸去預雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）..
2）60℃溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。
二.原位雜交第二天
1.
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。
3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復一次。
2.
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml1：2：7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C冰箱過(guò)夜。
三.原位雜交第三天
1）用1ml含10％熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。
2）用1ml1mM左旋米睉的Stainingbuffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去stainingbuffer，加上300ulBMPurpleAPSubstrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色。
4）每隔一小時(shí)觀(guān)察胚胎是否開(kāi)始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
原位雜交中溶液的配制：
PBS:
NaCl8g
KCl0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO40.24g
原位雜交
DEPCH2O1L
HCl調PH值至7.4
抽濾，滅菌
4%多聚甲醛：
多聚甲醛40g
PBS1L
加熱持續攪拌至溶液澄清。-20℃保存
PBST：
20XSSC:
Na3Citrate2H2O88.2g
NaCl175.5g
DEPCH2O至1L
抽濾，滅菌
SSCT：
SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存。
HYB+：
HYB-20ml
yeastRNA10mg
heparin1mg。
-20℃保存。
MAB：
maleicacid11.6g
NaCl8.8g
用固體NaOH（約7g）調至Ph=7.5
4℃保存
MABT
MAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.
10%blockingreagent:
blockingreagent8g
MAB72ml
1：2：7溶液：
滅活羊血清：10%BMblockingreagent：MABT=1：2：7
用時(shí)現配
Stainingbuffer：
Tris12.1g
pH9.5
Mgcl6H2O10.2g,
Nacl5.85g
Tween-201ml,
用之前加1M的左旋咪唑儲液，使之終濃度為1mM。
應用
意義
原位雜交：在研究DNA分子復制原理的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過(guò)氫鍵結合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鍵分子的特點(diǎn)，應用帶有標記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內待測核酸（RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀(guān)察目的mRNA或DNA的存在并定位；用原位雜交技術(shù)，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水平來(lái)探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。
判斷
對照試驗和ISHH結果判斷，和其它實(shí)驗方法一樣，并非ISHH的任何陽(yáng)性信號都是特異性的，故必須同時(shí)有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設置須根據核酸探針和靶核苷酸的種類(lèi)和現有的可能條件去選定。從理論上講，對照試驗設置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現實(shí)是不可能的。因此，在上述對照試驗中應任選設至少3～4種用以證實(shí)ISHH結果的可靠性。在上述試驗中，標明*者為比較可靠的對照試驗。
②如果具備相當的免疫組化抗血清，可用結合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應mRNA共存于同一細胞中。
③預先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進(jìn)行雜交。再進(jìn)行ISHH，其結果應為陰性。由于同義RNA探針和組織內mRNA序列順序是相同的，應用其進(jìn)行ISHH，結果應為陰性。
④檢測系統的對照如乳膠或酶顯色系統也應在無(wú)標記探針的情況下進(jìn)行。ISHH的最大優(yōu)點(diǎn)是它的高度特異性，它可測定組織、培養的單個(gè)細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應用高敏感度的放射性標記cRNA探針在理想的ISHH的實(shí)驗條件下檢測mR－NA，其敏感度可達到20個(gè)mRNA拷貝/每個(gè)細胞。由于雙鏈DNA的穩定性，在用ISHH定位DNA時(shí)很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長(cháng)于2kb的探針可以應用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時(shí)甚至在組織切片上的單個(gè)基因拷貝。正因為如此，對ISHH結果的解釋?xiě)稚髦貞B(tài)度，特別是前人未報告過(guò)的新發(fā)現。因為如前所述，影響ISHH實(shí)驗結果的因素太多，比如在外科或實(shí)驗取材后未及時(shí)的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導致假陰性結果。另外，在各種類(lèi)型核酸探針進(jìn)入細胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實(shí)驗結果。
熒光
熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子（reportermolecule）結合，雜交后再通過(guò)免疫細胞化學(xué)過(guò)程連接上熒光染料，FISH的基本原理是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針?lè )肿犹禺愋越Y合來(lái)檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長(cháng)期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，不但能顯示中期分裂相，還能顯示于間期核。同時(shí)在熒光原位雜交基礎上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù).
參考資料
[1]
原位雜交染色[引用日期2014-09-15]
[2]
研域(上海)化學(xué)試劑有限公司[引用日期2012-01-16]
[3]
價(jià)值中國網(wǎng)[引用日期2012-01-16]
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卡爾巴拉省是伊拉克的一個(gè)省份，位于該國中部。該省面積為5,034平方公里，人口數量為1,220,005人。省會(huì )卡爾巴拉是什葉派伊斯蘭教徒心中的圣城，因此在該省內有許多宗教建筑和遺址。該省也是伊拉克重要的文化和歷史中心，擁有豐富的文化遺產(chǎn)和歷史背景。
阿拉伯（阿拉伯語(yǔ)：???????），可指阿拉伯民族，也可指阿拉伯世界。阿拉伯民族起源于閃米特種族，是閃族最年輕的一支，親緣上與希伯來(lái)人相近。阿拉伯世界泛指阿拉伯人居住的地區，阿拉伯世界共有22個(gè)國家和地區。
希伯來(lái)語(yǔ):（????????）是猶太人民族語(yǔ)言，以色列通用語(yǔ)言，為世界上較為古老的語(yǔ)言之一?！跋２畞?lái)”意為“渡河而來(lái)”，屬于閃含語(yǔ)系閃米特語(yǔ)族的一個(gè)分支，沒(méi)有元音字母，只有22個(gè)輔音字母，其文字從右往左書(shū)寫(xiě)。許多希伯來(lái)文學(xué)作品和文獻都是用希伯來(lái)語(yǔ)寫(xiě)出來(lái)的，主要文獻保留在《死海古卷》和大量猶太教以及基
提比略·愷撒·奧古斯都羅馬帝國第二位皇帝提比略，全名提比略·愷撒·（神君奧古斯都之子·）奧古斯都（拉丁語(yǔ)：Tiberius Caesar Divi Augusti filius Augustus，公元前42年11月16日—公元37年3月16日），原名提比略·克勞狄烏斯·尼祿或提比略·尤里烏斯·愷撒（Tiberius Claudius Nero或Tiberius Julius Caesar），中文又
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作者
