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瓊脂糖
線(xiàn)性的多聚物
基本信息
| 中文名 | 瓊脂糖 |
| 外文名 | Agarose |
| 別名 | 瓊膠素、瓊膠糖 |
| 化學(xué)式 | C24H38O19 |
| 外觀(guān) | 白色或黃色珠狀凝膠顆?；蚍勰?/div> |
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概述
瓊脂糖
來(lái)源于紅藻的多糖，其主要成分為多聚半乳糖，其中約70%為瓊脂糖，30%為支鏈瓊脂糖。瓊脂糖具線(xiàn)型結構，由D-半乳糖和3,6-脫水半乳糖通過(guò)β-1，4和α-1，3連接交替形成重復雙糖單位。支鏈瓊脂糖則從β-1，3鍵分出另一鏈。用熱水從海藻抽提的物質(zhì)約含40%瓊脂。市售的瓊脂（俗稱(chēng)洋菜）常呈片狀或疏松繩索狀，通常作食用膠質(zhì)，藥物包裝劑或細菌培養基使用。純制的瓊脂糖常在生物化學(xué)實(shí)驗室中，作為電泳、層析等技術(shù)中的半固體支持物，用于生物大分子或小分子物質(zhì)的分離和分析。
瓊脂，它的英文名為agar。這個(gè)詞來(lái)源于馬來(lái)語(yǔ)的agar-agar，意思是膠狀物。又名瓊膠、菜燕、凍粉，是一類(lèi)從石花菜及其它紅藻類(lèi)（Rhodophyceae）植物提取出來(lái)的藻膠（phycocottoid），在我國及日本已有三百多年（1658年）的歷史。中國人亦稱(chēng)為洋菜或凍粉。日本人稱(chēng)之為寒天（kanten），因為它在冬天收獲。臺灣人叫它菜燕，和燕窩的質(zhì)感差不多。韓國人的叫法是??（不知道啥意思）。
計算化學(xué)數據
1.疏水參數計算參考值（XlogP）:無(wú)
2.氫鍵供體數量:0
3.氫鍵受體數量:1
4.可旋轉化學(xué)鍵數量:6
5.互變異構體數量:7
6.拓撲分子極性表面積17.1
7.重原子數量:15
8.表面電荷:0
9.復雜度:178
10.同位素原子數量:0
11.確定原子立構中心數量:0
12.不確定原子立構中心數量:0
13.確定化學(xué)鍵立構中心數量:0
14.不確定化學(xué)鍵立構中心數量:0
15.共價(jià)鍵單元數量:1
物化信息
中文名稱(chēng)：瓊脂糖
中文別名：瓊脂糖ME
英文名稱(chēng):Agarose
英文別名:Agarose, medium EEO, Molecular Biology Grade; agarose, mixture; Agaroseforelectrophoresisofmacromolecules;agarose for molecular biology; agarose 6 B for chromatography; Agarose LE; sepharose(R) 4B for chromatography;
CAS:9012-36-6;62610-50-8
EINECS:232-731-8
分子式:C24H38O19
分子量:630.5471
安全術(shù)語(yǔ):S24/25:Avoid contact with skin and eyes.;
物化性質(zhì)
熔點(diǎn):260-481.5℃
相對密度:1.81g/cm3
凝膠性能
瓊脂糖
1937年荒木第一次從瓊脂中分離出瓊脂糖，但直到1961年Hjertin首先發(fā)現了瓊脂糖優(yōu)異的使用性能后才引起了越來(lái)越多的關(guān)注，并開(kāi)始工業(yè)生產(chǎn)。瓊脂糖廣泛應用于臨床化驗、生化分析和生物大分子物質(zhì)的分離等領(lǐng)域。
用途
瓊脂、瓊脂糖因為有特殊的膠凝性質(zhì)，尤其有顯著(zhù)的穩固性、滯度和滯后性，并且易吸收水分，有特殊的穩定效應；已經(jīng)廣泛使用于食用、醫藥、化工、紡織、國防等領(lǐng)域，據不完全統計，瓊脂、瓊脂糖的用途已有1000多種，被國際上稱(chēng)為“新奇的東亞產(chǎn)品”。在食品工業(yè)中可用于生產(chǎn)：水晶軟糖、定型軟糖、水產(chǎn)品、肉類(lèi)罐頭、果汁飲料、果肉飲料、米酒飲料、乳品飲料、精品、乳品蛋糕。
由于其良好的生物相容性又廣泛用于生物分離介質(zhì)的生產(chǎn)。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，把瓊脂中的瓊脂果膠去掉，剩下的部分，就是瓊脂糖。
電泳技術(shù)
特點(diǎn)
天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下。
（3）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳后區帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長(cháng)期保存。
目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性?xún)惹泻怂崦笀D譜制作等。由于這種方法操作方便，設備簡(jiǎn)單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗方法之一。
DNA電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質(zhì)量及分子構型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
1．核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數成反比，因此通過(guò)已知大小的標準物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過(guò)20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開(kāi)。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴(lài)于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，分子大小不宜超過(guò)此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。
表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
瓊脂糖濃度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
線(xiàn)狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2．核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
不同構型DNA的移動(dòng)速度次序為：供價(jià)閉環(huán) DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線(xiàn)DNA>開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線(xiàn)雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長(cháng)軸方向前進(jìn)（Rm>0），由此可見(jiàn)，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
3．電泳方法
（1）凝膠類(lèi)型
用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時(shí)，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱(chēng)為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡(jiǎn)單，易于制作，又可以根據需要制備不同規格的凝膠板，節約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統
缺少離子時(shí)，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會(huì )大量產(chǎn)熱，嚴重時(shí)，會(huì )造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長(cháng)期貯存會(huì )出現沉淀，為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5×溶液，用時(shí)稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
（4）樣品配制與加樣
DNA 樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線(xiàn)性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場(chǎng)強度增加時(shí)，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著(zhù)電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強度不宜高于5V/cm。
電泳系統的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒(méi)有顯著(zhù)的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳，只有當凝膠濃度低于0.5%時(shí)，為增加凝膠硬度，可在4℃進(jìn)行電泳。
（6）染色和拍照
轉移電泳
生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離后的DNA進(jìn)行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進(jìn)行雜交操作，1975年，Southren創(chuàng )造了將DNA區帶原位轉移到硝酸基纖維素膜（NC膜）上，再進(jìn)行雜交的方法，被稱(chēng)為Southren印跡法。隨后，Alwine等將類(lèi)似方法用于RNA印跡，被戲稱(chēng)為Northern印跡，1979年Towbin等設計了將蛋白質(zhì)從凝膠轉移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質(zhì)轉移到膜上，再與相應的抗體等配體反應，被戲稱(chēng)為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉移。1982年Reinhart等用電轉移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區帶從凝膠轉移到特定膜上，稱(chēng)Eastern印跡。
目前國內外有多種核酸、蛋白質(zhì)印跡轉移的電泳裝置出售，使印跡轉移速度快效率高、重復性好，應用更加廣泛。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉移電泳，但轉移蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時(shí)比硝酸纖維素膜更方便。
進(jìn)行印跡轉移電泳時(shí)，要注意緩沖液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質(zhì)帶有較多電荷，一般用穩定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當提高電壓或電流可以提高轉移速度，但亦會(huì )增加熱效應，故電壓或電流不可過(guò)高。
凝膠電泳
一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過(guò)凝膠孔徑時(shí)，在電場(chǎng)作用下，迫使DNA變形擠過(guò)篩孔，而沿著(zhù)泳動(dòng)方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時(shí)改變電場(chǎng)方向，則DNA分子必須改變其構象，沿新的泳動(dòng)方面伸直，而轉向時(shí)間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。1983年Schwartz等人根據DNA分子彈性弛豫時(shí)間（外推為0的滯留時(shí)間）與DNA分子大小有關(guān)的特性，設計了脈沖電場(chǎng)梯度凝膠，交替采用兩個(gè)垂直方向的不均勻電場(chǎng)，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開(kāi)。后來(lái)Carle等改進(jìn)了電泳技術(shù)，并發(fā)現周期性的反轉換電場(chǎng)(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通過(guò)電泳分開(kāi)。電泳系統是由一水平式電泳槽和兩組獨立、彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板（10cm*10cm或20cm*20cm）呈45度放中央。電場(chǎng)在N-S和W-E之間交替建立。電場(chǎng)交替改變的時(shí)間長(cháng)短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。
電泳時(shí)，DNA分子處在連續間隔交替的電場(chǎng)中。首先向S極移動(dòng)，然后改向E極。在每次電場(chǎng)方向改變時(shí)，DNA分子就要有一定的時(shí)間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當DNA分子達到一定構型后，才能繼續前時(shí)。DNA分子凈移動(dòng)方向與加樣線(xiàn)垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區帶。交變脈沖電泳可有效分離數百萬(wàn)堿基對的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時(shí)間均可調，使用更加方便。
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