顯微攝影（應用于動(dòng)植物檢疫工作的技術(shù)）
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顯微攝影
應用于動(dòng)植物檢疫工作的技術(shù)
顯微攝影是通過(guò)顯微鏡來(lái)拍攝的方法。在動(dòng)植物檢疫工作上是科學(xué)研究、經(jīng)驗交流、仲裁談判不可缺少的手段之一。要取得良好的顯微攝影效果，最重要的是要有良好的顯微鏡設備和良好的顯微鏡操作技術(shù)。
基本信息
| 外文名 | Photographic photography |
| 拍攝工具 | 顯微鏡 |
| 方法 |
基本簡(jiǎn)介
意大利帕多瓦大學(xué)地質(zhì)學(xué)者伯納多·凱撒晃動(dòng)濾光器、瞄準鏡以及不斷變換方向，才拍攝到這張輝長(cháng)巖的微觀(guān)圖片。這些巖石沒(méi)有特別的科學(xué)意義，但里面有很多微小的橄欖石，看起來(lái)非常美麗。
操作方法
(1) 裝配
Olympus PM-10AD顯微攝影系統的裝配圖。
加選擇135相機拍攝時(shí)，首先應將適配器PM-PBS的上部裝上135照相機，前端裝上聚焦用望遠鏡PM-VTM。然后在顯微鏡的直筒部分加上適當倍數的NFK攝影目鏡(如3.3x)，并將上述PM-PBS安裝在該目鏡上。最后應將PM-PBS與自動(dòng)曝光控制器PM—CBAD之間的連接線(xiàn)裝好并分別將顯微鏡和PM-CBAD的電源接通，并注意檢查電壓選擇范圍是否與所用電源相匹配。
(2)用前檢查
在開(kāi)啟顯微鏡和曝光控制器電源后，在安裝膠卷前，應按以下方法先檢查該裝置的工作是否正常。其方法是：先將曝光裝置PM-PBS上的光路控制拉桿向外拉出—個(gè)位置(綠色環(huán))并把曝光控制器PM—CBAD上的曝光方式調至“AUT0”位，ASA速度至所用膠卷的感光速度ASA數值，這時(shí)再按下法檢查：
1)曝光控制器上的“SAFETY”綠色指示燈應亮。
2)輕按快門(mén)按鈕時(shí)，“WORK”燈應亮。
3)當快門(mén)關(guān)閉時(shí)，“WORK”燈應熄滅，并同時(shí)可見(jiàn)“WINDING”燈亮和聽(tīng)見(jiàn)卷片的馬達聲。
(5)黑白顯微攝影
先將拍攝標本準確聚焦，并用調焦望遠鏡選好待拍標本區。拍攝步驟如下：
1)將“MODE／EXPOSURE TIME”調至“AUTO”；按下“FORMAT”選擇鍵中的“35”；把“ASA”調至所用膠片的感光速度ASA值；將“RE-CIPROCITY，調至膠片的相應數值(可參見(jiàn)控制器底部的塑料說(shuō)明板，除特殊要求外，通常應放在“4”位上)。
2)檢查SAFETY指示燈是否為綠色，若為紅燈應作以下檢查：A．若紅燈
采用降低電壓以減小照明亮度的方法。B．若紅燈連續亮則表明曝光不足，應增
加亮度。
4)拉下控制器上的曝光鈕，“WORK”燈將隨著(zhù)曝光而開(kāi)啟，曝光結束“WORK”燈燈滅，膠片將自動(dòng)驅進(jìn)一個(gè)片位。
(6)135彩色膠卷顯微攝影
進(jìn)行彩色攝影的基本方法除色溫調節外，其余均與黑白顯微攝影相同。下面僅介紹調溫法；
1)將色溫檢測器PM-CTR安裝么自動(dòng)曝光器PM-PBS的左側。
2)將標本片聚焦后讓視野移至無(wú)樣品的地方。
3)將光路控制拉桿移至最外部(黃色帶)；把色溫調節旋至“D”（日光型膠卷)或“T”(燈光型膠卷)。
4)在顯微鏡上加LBT(燈光型膠卷)或LBD-2(日光型膠卷)濾光片，調節顯微鏡的亮度使色溫調節器上的指示燈亮至A處(黃色)；若A處以上的綠燈亮表明色溫過(guò)高；A處以下的紅燈亮時(shí)表明色溫過(guò)低。
行顯微攝影。
(7)手動(dòng)顯微攝影
在持殊情況下常常需要人為地改變曝光條件以求得更好的攝影效果經(jīng)驗的操作者也可以選擇手動(dòng)進(jìn)行顯微攝影，其方法如下：
1)用“MODE／EXP0SURE TIME”鈕自行選擇曝光時(shí)間(可從1s-40min)。
2)按快門(mén)鈕，這時(shí)的快門(mén)將按設定的時(shí)間曝光。
3)若需要曝光時(shí)間超過(guò)40m可將“MODE鈕旋至T再按下快門(mén)鈕，快門(mén)將一直開(kāi)啟，直至按動(dòng)“TIME OFF／WINDING”鈕。
(8)自動(dòng)曝光鎖定裝置的應用
在對同一標本片的不同位置或不同成分進(jìn)行攝影時(shí)，常常要采用相同的曝光
時(shí)間，這時(shí)可按下“AE LOCK”鍵。在此后的拍攝中將維持相同的曝光時(shí)間，“TIME RECALL”燈將閃亮，直至“AE LOCK”鍵被重新按動(dòng)后才被解除。
(9)多次重復曝光：其操作如下：
A．先將“ASA”鈕旋至8倍于膠片ASA值處(如將100ASA膠卷旋至800處)。
B．將“FORMAT”選擇的“L”鍵按下，這時(shí)就能對同一底片進(jìn)行多次曝光。
C.結束后按下“35”鍵和“WINDING鍵，膠片將自動(dòng)前進(jìn)一個(gè)片位。
曝光控制
顯微攝影
在控制曝光時(shí)，要注意以下因素：
光源強度的影響：由于電壓的變化，光源亮度可能產(chǎn)生5-10倍的變化。光源的距離及對標本的照射面積。光源的波長(cháng)及色溫。光源的波長(cháng)長(cháng)、色溫低，色光偏紅時(shí)，曝光時(shí)間要長(cháng)些。光波短，色溫高，色光偏青時(shí)，曝光時(shí)間要短些。電壓的波動(dòng)會(huì )引起曝光量的改變，所以攝制過(guò)程中要保持電壓的相對穩定。聚光器的位置經(jīng)過(guò)實(shí)驗固定后不宜改動(dòng)。使用濾色鏡、乳白玻璃、偏振鏡等都要按其曝光指數增加曝光時(shí)間（手動(dòng)曝光）。目鏡的放大倍率。以×5倍的目鏡作曝光基準1時(shí)，×10倍目鏡要4倍的曝光量，×15倍目鏡要增至9倍的曝光。物鏡的倍率和N·A值：如果把×10倍的目鏡作為1時(shí)，×40倍目鏡要2.5倍的曝光，×100倍的物鏡要4倍的曝光。從目鏡出射點(diǎn)到感光片的距離 標本的染色也會(huì )對曝光產(chǎn)生影響 標本與目鏡間的介質(zhì)折射率大、曝光時(shí)間短，反之，曝光時(shí)間長(cháng)。曝光時(shí)間與折射率成反比。聚光鏡的光闌孔徑變化能使曝光產(chǎn)生2～20倍的變化。
反差控制
顯微攝影
標本本身對反差的影響 標本切片厚會(huì )產(chǎn)生光的折反射，同時(shí)細部結構產(chǎn)生重疊。標本新鮮、色彩鮮艷反差強。標本載物片厚或蓋片厚、有色、有水紋都會(huì )降低反差。照明對反差的影響：照明應適中，否則會(huì )降低反差，太亮會(huì )沖擊標本細部結構，太暗會(huì )使光路中的臟物呈現在影屏上。光束直徑與視場(chǎng)直徑一致時(shí)反差強，光束直徑大于視場(chǎng)直徑就會(huì )降低反差。集光器與虹彩對反差的影響：集光器過(guò)低、虹彩與光欄小，都會(huì )降低反差，所以要依具體情況升降集光器或開(kāi)放虹彩。虹彩光闌的直徑必須與物鏡口徑一致。濾色片對反差的影響：用補色濾色片反差強，用統一色濾色片反差弱。
光學(xué)顯微攝影的反差雖然是大些為好，但也要適當處理，不然反差過(guò)大就會(huì )損失細部結構，同時(shí)也會(huì )影響分辨率，同樣不能得到完美的效果。
單式光學(xué)顯微鏡（通常用的放大鏡、解剖鏡等）光學(xué)結構簡(jiǎn)單、放大倍數小、光行差明顯，不宜進(jìn)行顯微攝影，在這里就不作介紹了。
復式顯微鏡光學(xué)系統比較完善、機械裝置比較復雜，適合于顯微工作的開(kāi)展：
1.顯微鏡的成像
顯微鏡的成象光路：
它通過(guò)目鏡、物鏡等光學(xué)器件構成放大光路，而使所得虛像A“B”的距離恰好等于人眼的鳴視距離——250毫米，以獲得將標本放大10～200倍的可見(jiàn)影像。
2.光學(xué)顯微鏡的基本結構
（1）接物鏡
接物鏡是光學(xué)顯微鏡的關(guān)鍵部件，整個(gè)顯微鏡系統的成像質(zhì)量與分辨率都由接物鏡決定。它 由一組精密的透鏡組成，其作用是將檢視標本做第一次放大。顯微接物鏡生產(chǎn)時(shí)做過(guò)各種像 差校正，它有一個(gè)光闌——孔徑光闌，可以控制入射光束的直徑，其作用是減小或擴大視場(chǎng) 而不改變像的明亮度。
接物鏡有不同倍率其中干燥系用在正常情況下觀(guān)察。水浸系或油浸系在觀(guān)察時(shí)要 在接物鏡口與標本結合處點(diǎn)水或點(diǎn)油。
由于接物鏡的成像質(zhì)量影響攝影效果和觀(guān)察效果，所以接物鏡也是顯微攝影的重要組成部分。
①N·A值
表明了物鏡數值孔徑與介質(zhì)折射系數、入射角的關(guān)系。理論上的最大入射角為180°，它的一半（90°）的正弦等于1，而空氣的折射系數為1.0，水的折射系數為1.33，松節油的折射系數為1.5，所以在同樣入射角情況下液浸物鏡數值孔徑比干燥物鏡的大，因此分辨能力也大得多。
N·A值越大，分辨率越大，N·A值越小，景深與焦深越長(cháng)。
N·A值尚與鏡口角有關(guān)，鏡口角越大，進(jìn)光量越大，所視像野中的影像越清楚，分辨率就越 大。反之，分辨率就小以致看不清楚。由于低倍物鏡的鏡口角小于高倍物鏡的鏡口角，所以低倍物鏡的分辨率就不如高倍物鏡的分辨率大。（這是指干燥系而言，油浸系物鏡有介 質(zhì)的折射率，可提高分辨率。
分辨率還受照明強度及光源波長(cháng)的影響，在一定范圍內，照明強度大，分辨力就大。
②放大率
放大率是指檢視的放大倍率（即虛像放大倍率），倍率越大，工作距離越近。對每個(gè)具體物 鏡來(lái)講，它的放大倍率是不變的，工作距離也是不變的。如果采用10×目鏡、40×物鏡，觀(guān) 察時(shí)放大了400倍，但對顯微攝影來(lái)講，由于要增加目鏡到 感光片的這段距離就不是400倍了，有些顯微攝影的攝影倍率是顯微鏡放大倍率的1/2。
③對蓋片厚度的要求
顯微鏡對蓋片的厚度要求為抽筒的1/100,達0.16～0.17毫米，每差±0.01毫米抽筒則必須相 應改動(dòng)10毫米，否則其放大倍率就不是標示的倍率了。
常用于油浸鏡的點(diǎn)油及折射率為：
洋杉木油1.51
檀香木油1.51
甘油1.46
樹(shù)膠1.52
蘇合香1.58
折射率越大呈像亮度越強，分辨率也就越大。
（2）接目鏡
接目鏡主要有以下兩個(gè)作用一是將物鏡送來(lái)的初級放大影像再作第二次放大。
二是矯正接物鏡成像中的相差、色差和照度。接目鏡的放大率一般從×4～×25，其鏡筒長(cháng)的放大倍率大，反之，放大倍率則小。
眼點(diǎn)是目鏡的一個(gè)主要參數，在顯微攝影中為尤重要。眼點(diǎn)即顯微鏡對清焦點(diǎn)后在目鏡上形 成的出射點(diǎn)。一般眼點(diǎn)距離目鏡0.5厘米左右，放大倍率越大，這段距離越短，放大倍率越 小，這段距離越長(cháng)。目視時(shí)，瞳孔恰與此點(diǎn)相接，用帶鏡 頭的照相機攝影時(shí)，鏡頭的前片透鏡表面要與此點(diǎn)相接，用不帶鏡頭的攝影裝置拍攝時(shí)，要 從眼點(diǎn)計算所加近攝裝置（伸縮皮腔形式或近攝接圈）的伸長(cháng)尺寸，以計算實(shí)際倍率。
（3）聚光器
①明視野聚光器
明視野聚光器由集光器、虹彩、濾色鏡環(huán)和反射鏡四個(gè)部分組成。
其中集光鏡由兩個(gè)或兩個(gè)以上透鏡組成，象一個(gè)簡(jiǎn)單的照相機鏡頭，它的數值孔徑（N·A) 值為1.20～1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物鏡對標本的分辨率。
②虹彩
結構像照相機的光圈，它不但可以調節照明強度，同時(shí)還具有改變分辨率和反差的作用，即：虹彩開(kāi)大，分辨力高，反差弱，虹彩縮小則相反。濾色鏡環(huán)用來(lái)放置濾色片或毛玻璃，可 用來(lái)改變光色或亮度。
反光鏡分為平凹兩面，并要使光束正好對準反光鏡中央。
③暗視野聚光器的視野背景是暗的，被攝體是發(fā)光的或明亮的。
暗視野聚光器通常用于拍攝極微小的物體，如化學(xué)明膠、梅毒螺旋體或明視野看不見(jiàn)、看不 清沒(méi)有染色的標本。它也常常用于熒光顯微攝影。使用暗視野聚光器拍攝時(shí)光源亮度要強些，不能使用濾色鏡。為防止外來(lái)光線(xiàn)干擾，暗視野 顯微攝影最好在暗室中進(jìn)行。
3.光學(xué)顯微鏡的主要性能
光學(xué)顯微鏡的主要性能從兩方面體現，即放大倍率和分辨率。
（1）放大倍率
理論上講，光學(xué)顯微鏡的放大倍率在鏡筒長(cháng)度為16～17厘米時(shí)為物鏡×目鏡倍率，但是我們 要 將實(shí)物看清，不僅僅是要將其放大，更主要的是分辨出它的細部形態(tài)，所以放大倍率要與物 鏡、分辨率同時(shí)考慮。如，同樣是放大200倍的顯微鏡目鏡與物鏡，可以有三種組合方式，4 0×5、20×10、10×20，但是三種組合形式的分辨率、焦點(diǎn)深度與成像面的亮度、拍攝時(shí)需 要使用的快門(mén)速度有很大差別。
物鏡（1） 20×10 （2） 41×5 （3） 10×20
物鏡的數值孔經(jīng) 分辨能力 焦點(diǎn)深度 焦平面亮度比 照相快門(mén)速度 0.40 0.70μ 1.25μ 1.0 1/30秒 0.65 0.43μ 0.77μ 0.8 1/200秒 0.25 1.1μ 2.0μ 0.4 1/40秒
在顯微攝影中，其放大倍率與出射點(diǎn)至感光片的距離有關(guān)，所以顯微攝影的放大 倍率的計算公式為M=物鏡倍率×目鏡倍率×目鏡出射點(diǎn)至底片的距離/250毫米。這個(gè)公式說(shuō) 明，只有當目鏡出射 點(diǎn)至感光片的距離為250毫米時(shí)，顯微攝影的放大倍率才等于物鏡倍率×目鏡倍率，若將目 鏡 出射點(diǎn)到感光片的距離加大，其放大倍率也隨著(zhù)加大，但這只是形態(tài)增大而分辨率不變。將 底片用來(lái)放大照片時(shí)也只是形態(tài)的放大，而不增加分辨率。
感光材料
藻類(lèi)共存
在這張硅藻和紅藻的照片中，有機體與健康生態(tài)系統之間的聯(lián)系被以微觀(guān)形式表現出來(lái)，各種生命形態(tài)需要互相依賴(lài)才能生存。
實(shí)用顯微攝影的方法主要有三種（注：不包括本實(shí)驗所用的相紙感光）：
第一種方法是利用傳統的菲林相機，讓被攝物體成像于黑白或彩色膠片上，制成負片，再把它沖印放大成照片（正片），以便觀(guān)察研究和永久保存?；蛘咦尡慌臄z物體成像于反轉片上，直接制成正片，用于幻燈投影。要求不高時(shí)也可直接成像于相紙上，成為一負片，并不影響相片的分辨率。本物理實(shí)驗室為本、專(zhuān)科學(xué)生提供這一顯微攝影廣方法。
第二種方法是利用數碼相機，通過(guò)專(zhuān)用接筒或外接專(zhuān)用鏡頭，把被攝物體成像于數碼相機的內存中。成為一個(gè)壓縮的JPEG文件，傳輸到計算機中，再利用圖像顯示軟件把圖像顯示于監視器上，或者直接通過(guò)打印機輸出相片來(lái)。也可把圖像存貯于媒介上，如軟盤(pán)、閃存盤(pán)、光盤(pán)等，再通過(guò)數碼沖印商店，沖印出數碼相片。由于目前市場(chǎng)上大多數數碼相機都是不可變換鏡頭的相機（除了個(gè)別昂貴的專(zhuān)用數碼相機，如Nikon的Ｄ1型相機外），所以顯微鏡不設連接數碼相機的卡口，而通過(guò)加設一鏡頭接筒的方法，再連接某些特殊鏡頭結構的數碼相機，如本實(shí)驗采用的Nikon Coolpix 4500型數碼相機。
第三種方法，則是在顯微鏡上加接專(zhuān)用連接鏡頭，接上CCD攝錄鏡頭，再把動(dòng)態(tài)的圖像傳送到計算機，通過(guò)軟件在顯示器上表現出動(dòng)態(tài)圖像來(lái)，可把Video圖像存儲成某種格式的文件，如avi、mpeg或mov等。也可把瞬間的影像保存到計算機中，成為儲存器上的一靜態(tài)圖像的文件，如bmp、tif或jpg等，與數碼相機所獲得的圖像相似。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠獲得動(dòng)態(tài)圖像，在視覺(jué)效果上更生動(dòng)、更勝一籌。不過(guò)其靜態(tài)圖像的分辯率一般只能用于電視機或顯示器上的顯示，并不適合于打印輸出和印刷等領(lǐng)域。
微觀(guān)世界
植物生殖器官
這是一張被顯微鏡放大了20倍的雄株芥末類(lèi)植物的生殖器官，摘走了2009年尼康微觀(guān)世界攝影大賽的桂冠。擬南芥是第一種完成全部基因組序列測定的高等植物，也是最常用于科學(xué)研究的植物，但這種植物此前卻從未展示過(guò)藝術(shù)美感。
續斷菊花莖這是一張續斷菊花莖部的橫截面圖片，續斷菊是鄉間最常見(jiàn)的一種黃色野花。攝影師格雷德·岡瑟說(shuō)：“續斷菊毛狀物的紅帽與綠白相間花莖之間的強烈對比，令我感到戰栗?！边@張圖片是在被放大150倍拍攝的，顯示出自然界的神奇。
光刻膠是工業(yè)生產(chǎn)中常用的感光材料。在200倍顯微鏡下，看起來(lái)非常美麗，就像太陽(yáng)用其龐大熱能溫暖著(zhù)地球。
卵巢螺旋這是一個(gè)發(fā)育中的卵子，在琵琶魚(yú)的卵巢中做螺旋式移動(dòng)。攝影師在卵巢壁上加了顏色，看起來(lái)特別明顯。這幅圖既有其藝術(shù)美感，又具有科學(xué)價(jià)值，可以證明卵巢和卵子的結構。
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作者
